种质资源保存方法之五种子超干保存法
19.09.2014 20:01
本文来源: 林业厅
采用室温硅胶干燥法。种子放置于尼龙网袋中，埋于干燥器内硅胶中，硅胶与种子重量比为5:1~10:1，25℃室温脱水干燥，每天更换经120℃充分干燥冷却后的硅胶。每隔一定时间称重，以制备不同含水量的种子。干燥至预定含水量之后，用双层铝箔袋分袋包装。所有种子干燥包装后测定种子活力。将不同含水量的种子分别保存在45℃、室温和15℃。保存时间1~3年。
2种子含水量和种子活力的测定
根据《国际种子检验规程》(ISTA，1993)的技术标准进行。采用120℃烘干法测定种子原始含水量，重复三次。种子活力的测定按《国际种子检验规程》(ISTA，1993)的有关规定进行。3个重复，每个重复100粒种子，经1%次氯酸钠表面消毒后，用蒸馏水充分冲洗干净，放入铺有滤纸的培养皿中，置于25℃培养间进行发芽试验，每天补充水分。以连续5天不再有种子发芽作为发芽结束期，每天记录发芽种子数，发芽至一定时间(国际标准或者最高发芽势时的天数)，记录胚根的长度(取30株并测定其平均值)，以计算种子活力指数(黄学林等，1990)。
发芽指数(Gi)=∑Gt/Dt
Gt:浸种后t日的发芽数;Dt:相应发芽日数
活力指数(V.I)=SGi
S:幼苗生长势(平均长度或者干重、鲜重)
3超干种子的缓湿处理
将不同含水量的种子置于尼龙网袋中，依次放入饱和氯化钙溶液(CaCl2，20℃相对湿度35%)、饱和氯化铵溶液(NH4CI，20℃相对湿度70%)以及水(相对湿度100%)所造成的相对湿度环境的干燥器中，密封，室温下平衡48小时，进行逐级缓湿处理。
4超干种子人工老化处理
将不同含水量的超干种子放入50~60℃的恒温箱中进行人工老化处理，测定相关生理活性指标。以不经过超干的种子作为对照。
5相对电导率的测定
取种子30~50粒，用自来水洗净，再用超纯水冲洗数次，用滤纸吸干浮水，放入烧杯。加入100ml超纯水浸泡，25℃下浸泡，取不同时间间隔测电导率，再在沸水中煮15min，然后冷却到25℃测电导率。以不加种子的超纯水作空白对照。每个处理3个重复。电导率仪采用DDSJ-308A型(上海精密科学仪器有限公司)。
电导率=((电导测定值-空白值))/种子重量—╳电导池常数
相对电导率(SI)=S1/S2╳100
S 1为25℃电导率；S2为绝对电导率
6酶液的提取及相关酶活性的测定
取子叶10克，加3-5毫升Na2HPO4-NaH2 PO4缓冲液(50mmol/L， pH7.0)冰浴，研磨成匀浆。在4℃的条件下，20000转/分，离心20min。上清液即为酶提取液。过氧化物酶(POD)测定:200ul酶液加入3.4ml Na2HPO4- NaH2 PO4缓冲液(25mmol/L pH7.0内含0.1mmol/L EDTA-Na2)，200ulH2 O2:(10mmol/L)，200ul0.05%愈创木酚，25℃下反应。测定OD470的动力学变化，取其中10秒的动力学变化计算酶促反应速率。吸光系数为26.6mM-1.cm-1。
过氧化氢酶(CAT)测定:取上清液50ul入试管中，加入25mM的磷酸缓冲液(pH7.0，含0.1mM的EDTA)3.4ml，100mM的H202200ul，在25℃下反应，测定OD240的动力学变化。取其中10秒的动力学变化计算酶促反应速率。吸光系数为39.4mM-1.cm-1。
超氧化物歧化酶(SOD)测定:采用SOD抑制氮兰四哩(NBT)在光下的还原作用来测定SOD活性。在较暗的光下加入3ml反应液(由50mmol/L pH7.8的磷酸缓冲液，13mmol/L甲硫氨酸，63umol/LNBT，l.3umol/L核黄素和0.lmmol/L EDTA配置而成，用时现配)和25ul酶提取液，在SOD光照反应箱中进行光照反应17min，25℃，于560nm下进行光密度测定。SOD活性以抑制NBT光化学反应的50%为一个酶活性单位。按下列公式计算活性: 酶单位/样品量=(反应被抑制%)/((50%)╳3ml反应混合液中加入的样品量)
丙二醛含量(MDA)测定:参照TBA法(王爱国等，1986)。取0.3g种子用0.1%三氯乙酸3ml均浆，10000rpm冷冻离心5min，取上清液1ml，加 4ml 0.5%硫代巴比妥酸，混均后在95℃水浴保持30min，用冰水迅速冷却至室温，混合物于10000rpm冷冻离心10min，在532nm和600nm下读光密度值。
活性计算:(A532 nm—A600nm)x155X0.005╳3/g.w。单位:μmol/g.w。
挥发性醛含量测定:在培养皿铺两层滤纸，加入用1%次氯酸钠消毒过的种子，在一定温度下吸胀处理若干小时，打开培养皿玻璃盖，用滤纸擦干培养皿中剩余的水分，加入3ml 0.2%MBTH(3-甲基-2苯并噻腙酸盐)溶液以吸收种子释放出的挥发性醛，盖上玻璃板，用凡士林密封。经过一段时间后用吸管从培养皿中收集挥发性醛的吸收液，测定其中挥发性醛的含量。重复三次。
脂氧合酶(LOX)测定:20ul酶提取液加上30ul亚油酸钠(25mmol/L)，2.95ml硼酸缓冲液 (0.2MpH9.0)，反应温度30℃。加酶液后15秒开始计时，在234nm下测定1min内的OD值变化。酶活性以△OD234.min-1.mg-1pro表示。
脱氢酶活性测定:采用即简化TTC(2，3，5—氯化三苯基四哇氮)定量法(胡晋，龚利强，1994)。每处理取种子25粒，室温下浸泡24h，在种子中心刺破种皮，加入0.1%TTC溶液10ml，在38℃黑暗条件下反应24h，倒去TTC溶液，用无离子水冲洗种子表面数次，用滤纸吸取种表水分，置于具塞试管内加入10m!丙酮于40℃条件下抽提6h，在分光光度计上比色(波长490nm)，测定光密度。
TTC标准曲线配制:在容量瓶中配0.1%TTC母液。取5ml容量瓶5个，每个瓶中加入极少量的强氧化剂连二亚硫酸钠(Na2S204)，用微量注射器分别加入0.1%TTC溶液25、50、75、100、150ul，加水定容。在490nm波长下测定光密度值，绘制标准曲线。
淀粉酶测定:用45℃的温水自然冷却浸种24h，取胚4个重复，每个重复100粒种子，把胚移入研钵中加入少量分析纯石英砂和5ml研磨缓冲液冲洗，转移到试管中，将提取液放在70℃恒温中加热20min，在4000转/min离心机中离心5min，倾出上清液，用研磨缓冲液定容至10ml，作为酶制剂，吸取1ml酶制剂放入试管中，加入1ml淀粉溶液和1ml反应缓冲液，摇匀放在37℃的恒温水浴中保温，经过0min、5min、10min，分别吸取0.3ml的反应混合液放入试管中，迅速加入1ml显色剂，加入3ml蒸馏水，充分摇匀，用721型分光光度计(上海安亭仪器厂)在620nm的波长下测其光密度值，得到OD620(0)、OD620(5)和OD620 (10)，计算5min和10min的光密度变化值△OD620 (5)和△OD620 (10)(黄学林等，1990)。
种子呼吸强度的测定:种子发芽初期的呼吸强度随发芽时间逐渐增大到一定程度就稳定在一定水平，为了测定效果更好，一般使种子置床后在种子发芽高峰期时测定，本次试验采用G犯诬一305型便携式红外线分析器(北京兴争仪器厂)测定，方法参照宋松泉等(2005)。每个处理4个重复，每个处理100粒种子。
7引物筛选
从RAPD随机引物中筛选出条带清晰、多态性高、反应稳定并且重复性好的引物进行扩增。
8超干保存后RAPD分析
DNA提取:参照CTAB法提取DNA，最后将DNA浓度稀释为工作液。
DNA扩增反应参考张勇(2006)。反应程序参考许勇等 (1998)PCR反应程序。
电泳检测:反应产物在1.0%琼脂糖凝胶(EB， 0.5μg/ml)，0.5╳TBE电泳缓冲液 (pH8.0)中进行电泳分离，数码凝胶成像分析系统观察结果并保存。
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